近日，植物保護學院李向東教授團隊在《Plant Biotechnology Journal》在線發表了題為“RabE1a-and SEC10b-mediated exocytosis and AP2-mediated endocytosis are involved in the intracellular transport of tobamoviruses”的研究論文。該研究揭示了番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV）等煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）在寄主細胞內的移動的分子機制，并鑒定到抗病毒新靶標。
ToBRFV對全球番茄、辣椒等茄科作物構成嚴重威脅。ToBRFV自2014年首次發現以來，已在全球范圍內暴發流行。目前，廣泛用于防控煙草花葉病毒屬病毒中煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）的番茄抗性基因Tm-22，對ToBRFV沒有抗性，亟需尋找新的分子靶標。李向東教授團隊發現ToBRFV的移動蛋白（movement protein，MP）首先通過RabE1a和SEC10b介導的分泌途徑移動到質膜，隨后依賴AP2β介導的內吞途徑從質膜轉移動到胞間連絲，實現細胞間移動。敲除或沉默RabE1a、SEC10b、AP2β等基因，均可顯著抑制ToBRFV及TMV、ToMV、ToMMV等煙草花葉病毒屬病毒的侵染。研究結果為抗ToBRFV等煙草花葉病毒屬病毒的育種提供理論基礎。全文主要研究結果如下：
1.RabE1a參與ToBRFV在植物中的細胞間移動
為了明確RabE1a在ToBRFV侵染中的作用，研究者使用CRISPR/Cas9基因編輯技術在番茄栽培種Ailsa Craig中敲除了SlRabE1a。在接種后8天后，與野生型番茄植株相比，Slrabe1a敲除植株的系統葉表現出較輕的癥狀（圖1A）。Western blotting結果顯示，Slrabe1a敲除株系番茄植株中的ToBRFV衣殼蛋白積累水平顯著低于對照植株（圖1B）。這些結果表明，SlRabE1a參與ToBRFV的系統侵染。研究者構建了NbRabE1a.1敲降的轉基因本氏煙系NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#。RT-qPCR結果顯示，NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#植株中NbRabE1a.1的沉默效率分別達到66%和92%（圖1C）。隨后，研究者接種了侵染性克隆pCBToBRFV-GFP。在接種后6天，接種了ToBRFV-GFP的野生型本氏煙植株的系統葉呈現出明顯的綠色熒光，但在NbRabE1a.1-KD2#或NbRabE1a.1-KD4#植株中分別觀察到微弱熒光或無熒光（圖1D）。在野生型本氏煙植株中檢測到ToBRFV CP的積累，但在NbRabE1a.1-KD2#或NbRabE1a.1-KD4#植株中檢測到的CP積累量很少或沒有（圖1E）。
為進一步研究RabE1a在ToBRFV細胞間運動中的作用，研究者將攜帶ToBRFV-GFP侵染性克隆的農桿菌OD600值調整至0.0001，并將其農桿菌浸潤到野生型和NbRabE1a.1-KD本氏煙葉片中。在接種后84小時，NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#植株浸潤葉片中ToBRFV-GFP侵染點的熒光直徑顯著小于野生型本氏煙植株葉片中的熒光直徑（圖1F和1G）。這些結果表明RabE1a在ToBRFV細胞間運動中起關鍵作用。
為了確定沉默RabE1a.1是否影響ToBRFV MP的PD定位，研究者在野生型和NbRabE1a.1-KD本氏煙植株的葉片中瞬時表達ToBRFV MP-GFP。在農桿菌浸潤后48小時，通過共聚焦顯微鏡觀察浸潤區域。結果顯示，NbRabE1a.1-KD葉片中MP-GFP的熒光強度低于野生型本氏煙葉片（圖1H和1I）。Western blotting結果顯示，野生型本氏煙和NbRabE1a.1-KD葉片中MP-GFP的表達水平沒有顯著差異（圖1J）。這些結果表明，RabE1a調控MP向PD的轉運，從而影響ToBRFV的細胞間運動。
圖1. RabE1a在ToBRFV系統侵染和細胞間運動中發揮關鍵作用。
2.RabE1a與SEC10b相互作用，共同調控MP向質膜的轉運以及ToBRFV的細胞間運動
為研究SlRabE1a調控MP向質膜轉運的機制，研究者分析了SlSEC10b與SlRabE1a之間的相互作用。Co-IP結果顯示，SlRabE1a可以與SlSEC10b相互作用(圖2A)。BiFC實驗進一步證實了它們的相互作用(圖2B)。
為檢驗SEC10b是否對病毒侵染至關重要，研究者通過TRV載體在番茄植株中沉默了SlSEC10b。沉默12天后，對SlSEC10b沉默的番茄植株接種ToBRFV。接種后8天，接種TRV-GUS對照的番茄植株系統葉中的花葉癥狀比接種TRV-SlSEC10b的植株更嚴重(圖2C)。RT-qPCR結果顯示，SlSEC10b沉默的番茄植株中SlSEC10b mRNA 的水平約為對照植株的40%(圖2D)。Western blotting 顯示，SlSEC10b沉默的番茄植株中CP積累水平約為對照植株的49%(圖2E)。共聚焦顯微鏡分析結果顯示，NbSEC10b沉默植株浸潤葉片中的ToBRFV-GFP侵染點顯著小于對照植株(圖2F和2G)，表明在本氏煙葉片中沉默NbSEC10b減少了ToBRFV的細胞間運動。先前的研究表明，小分子化合物endosidin2(ES2)特異性靶向分泌囊泡復合體的一個保守亞基EXO70，并破壞其在介導分泌囊泡錨定及質膜融合過程中的關鍵功能，最終導致分泌途徑受到抑制。為進一步研究分泌途徑在介導ToBRFV細胞間運動中的作用，在本氏煙植株接種ToBRFV-GFP后48小時用ES2進行處理。共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，處理后48小時，與對照組相比，ES2處理顯著抑制了ToBRFV的細胞間運動(圖2H和2I)。
為確定沉默SEC10b是否影響ToBRFV MP的胞間連絲定位，研究者在NbSEC10b沉默和非沉默植株的葉片中瞬時表達了ToBRFV MP-GFP。農桿菌浸潤后48小時，通過共聚焦顯微鏡觀察浸潤區域。結果顯示，NbSEC10b沉默葉片中MP-GFP的熒光強度低于非沉默葉片(圖2J和2K)。Western blottin結果顯示，NbSEC10b沉默和非沉默葉片中MP-GFP的表達水平沒有顯著差異(圖2L)。
隨后，研究者檢測了NbSEC10b沉默和非沉默植株葉片質膜中MP的積累情況。結果顯示，沉默NbSEC10b顯著降低了MP在質膜中的積累(圖2M)。這些結果表明，RabE1a與SEC10b相互作用，共同調控MP向質膜和胞間連絲的轉運，從而促進ToBRFV的細胞間運動。
圖2. RabE1a與SEC10b相互作用共同調控MP向質膜的轉運和ToBRFV細胞間移動。
3.銜接蛋白AP2β與MP相互作用，調控MP從質膜到胞間連絲的運輸以及ToBRFV細胞間移動
研究者進一步分析了內吞途徑是否參與ToBRFV的細胞間運動。由于AP2復合體通過識別貨物蛋白參與網格蛋白介導的內吞途徑，研究者進一步探討了AP2復合體是否識別MP。BiFC實驗表明ToBRFV MP 與SlAP2β相互作用（圖3A）。Co-IP結果進一步證實了MP與SlAP2β之間的相互作用（圖3B）。
為測試SlAP2β在ToBRFV侵染中的作用，研究者通過TRV載體在番茄植株中沉默了SlAP2β（圖3C）。隨后，研究者將ToBRFV接種到SlAP2β沉默和非沉默的番茄植株中。在接種后8天，接種TRV-SlAP2β的植株系統葉表現出的癥狀比接種TRV-GUS對照的植株輕（圖3D）。Western blotting結果顯示，沉默SlAP2β降低了ToBRFV的積累水平（圖3E）。研究者進一步構建了NbAP2β-KD轉基因本氏煙系NbAP2β-KD7#和NbAP2β-KD8#。共聚焦顯微鏡分析顯示，NbAP2β-KD植株浸潤葉片中的ToBRFV-GFP侵染點小于對照植株（圖3F和3G）。此外，研究者發現NbAP2β的敲低顯著降低了胞間連絲和質膜處GFP的相對熒光強度（圖3H和3I）。盡管ToBRFV MP在胞間連絲的定位減少，但其在NbAP2β敲低葉片中的總積累水平顯著高于對照植株（圖3J）。這些結果表明AP2β參與MP轉運到胞間連絲。
研究者進一步檢測了野生型和NbAP2β-KD本氏煙葉片中質膜富集MP的積累情況。結果顯示，敲低AP2β增加了MP在質膜的積累（圖3K）。這些發現表明AP2β調控MP從質膜到胞間連絲的轉運，從而促進ToBRFV的細胞間運動。
圖3. AP2β與MP相互作用，參與MP從質膜轉運至胞間連絲以及ToBRFV的細胞間運動
4.RabE1a與煙草花葉病毒屬病毒的MP互作并調控病毒的細胞間運動。
為研究SlRabE1a是否調控其他煙草花葉病毒屬病毒的侵染，研究者驗證了SlRabE1a與TMV、ToMV和ToMMV的MP之間的相互作用。Co-IP實驗顯示，SlRabE1a可以與TMV、ToMV和ToMMV的MP相互作用(圖4A)。BiFC實驗進一步證實了這些相互作用(圖4B)。在番茄植株中敲除SlRabE1a抑制了TMV、ToMV和ToMMV的系統侵染(圖4C和4D)。在本氏煙植株中沉默NbRabE1a.1也抑制了TMV、ToMV和ToMMV的細胞間運動(圖4E和4F)。這些結果表明RabE1a在煙草花葉病毒屬病毒的系統侵染和細胞間運動中至關重要。
圖4. RabE1a與另外三種煙草花葉病毒屬病毒MP相互作用，并參與了這三個病毒的細胞間運動。
5.ToBRFV MP細胞內移動的推測的模型
總之，研究者提出了一個模型，其中MP劫持分泌途徑和內吞途徑以參與ToBRFV的胞內運動（圖5）。ToBRFV MP與RabE1a相互作用，并劫持由RabE1a和SEC10共同調控的分泌途徑到達質膜。到達質膜后，MP與AP2β相互作用，劫持內吞途徑到達胞間連絲，然后以核糖核蛋白復合體的形式通過胞間連絲進入鄰近細胞。研究結果全面展示了MP的胞內運輸過程，并為培育抗ToBRFV及相關煙草花葉病毒屬病毒的番茄種質資源提供了新的靶點。
圖5. RabE1a和SEC10b介導的分泌途徑以及AP2β調控的內吞途徑在ToBRFV胞內運輸中的作用模型。
山東農業大學博士研究生馬華玉為第一作者，李向東教授和閆志勇博士為共同通訊作者，田延平教授、江軍教授、耿超副教授參與了研究工作。該研究受到國家自然科學基金以及山東省泰山學者建設工程等項目的資助。
論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70138
編 輯：萬 千
審 核：賈 波
